1、學(xué)習(xí)并掌握食品中菌落總數(shù)測定方法和原理。
2、了解菌落總數(shù)測定在對被樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價中的意義 。

1、菌落總數(shù)

食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時等）培養(yǎng)后，所得每mL(g)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。

一定條件包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、是否需要氧氣等。在GB 4789.2-2022的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在平板計數(shù)瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。

菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細(xì)菌總數(shù)，也不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，只包括一群在計數(shù)平板瓊脂中生長發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的菌落總數(shù)，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。

2、菌落總數(shù)測定的衛(wèi)生學(xué)意義：

（1）食品本身的新鮮程度

（2）加工、貯存運(yùn)輸過程中是否受到污染--衛(wèi)生質(zhì)量

（3）衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)：食品中細(xì)菌菌落總數(shù)越多，則食品含有致病菌的可能性越大，食品質(zhì)量越差；菌落總數(shù)越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合大腸菌群和致病菌的檢驗，才能對食品做出較全面的評價。

3、2022版國家標(biāo)準(zhǔn)的主要變動：

三、流程：

拍擊式均質(zhì)

方便：只需購置一次性無菌均質(zhì)袋，無須提前準(zhǔn)備無菌容器；省去手工操作。

快捷：1-2分鐘內(nèi)幫您完成均質(zhì)工作。

科學(xué)：均質(zhì)過程不會產(chǎn)生高溫。但是不適合均質(zhì)堅硬樣品，如魚骨。 

稀釋液——磷酸鹽緩沖液or生理鹽水。

如果樣品pH較低，建議使用磷酸鹽緩沖液，以免影響培養(yǎng)基的凝膠強(qiáng)度。

培養(yǎng)基——平板計數(shù)瓊脂。

關(guān)于均質(zhì)器使用效果和對檢測結(jié)果的影響，有不同的報道：

1、不同食品樣品采用不同的均質(zhì)方法，測試結(jié)果不同。

2、不同的均質(zhì)方式對金黃色葡萄球菌和霉菌、酵母菌的檢測的影響也不同。

（二）、樣品稀釋：

1、樣品的稀釋。

2、制備好樣品勻液后,用1mol/L氫氧化鈉或1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.6~7.2。

3、接種。

4、培養(yǎng)。

瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h。

（三）、培養(yǎng)注意事項：

根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求和對樣品污染情況的估計，選擇1~3個稀釋度。加入樣品時要注意外來的污染。

培養(yǎng)基傾注的溫度與厚度是實驗正確與否的關(guān)鍵。（傾注的溫度：一般46~50℃，溫度過高會造成已受損傷的菌細(xì)胞死亡。厚度：直徑9cm的平皿一般要求15~20mL培養(yǎng)基，若培養(yǎng)基太薄，在培養(yǎng)過程中可能因水分蒸發(fā)而影響細(xì)菌的生長）。

為防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在加入樣液后，應(yīng)在15min內(nèi)傾注培養(yǎng)基。檢樣與培養(yǎng)基混勻時，可先向一個方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反方向旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)防止混合物濺到皿邊的上方。

1、培養(yǎng)基凝固后，應(yīng)在盡快將平皿翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，保持瓊脂表面干燥，盡量避免菌落蔓延生長，影響計數(shù)。

2、為控制污染，在實驗過程中，應(yīng)在工作臺上打開一塊瓊脂平板，其暴露時間應(yīng)與檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長時間相當(dāng)，然后與檢樣一同培養(yǎng)，以了解檢樣在操作過程中有無受到來自外界的污染。培養(yǎng)溫度:每種不同樣品中的細(xì)菌都有一定的生理特性，培養(yǎng)時應(yīng)用不同的營養(yǎng)條件及生理條件可能得出不同的結(jié)果，因而應(yīng)根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。

3、食品：36±１℃，48±2h 。

4、飲用水：36±１℃，48h 。

5、水產(chǎn)品：30±１℃，72±3h。(36℃培養(yǎng)和30℃培養(yǎng)結(jié)果差別較大，同樣水產(chǎn)品48h結(jié)果和72h也有差別。

（四）、對照試驗的要點：

1、檢樣的稀釋液中往往帶有食品顆粒，在這種情況下，為避免與細(xì)菌菌落混淆，可作一檢樣對照，不經(jīng)培養(yǎng)，置4℃環(huán)境放置，在計數(shù)時用于對照。

2、或可選用TTC營養(yǎng)瓊脂作培養(yǎng)基。

菌落計數(shù)的要點：

1、如果高稀釋度平板上的菌落數(shù)比低稀釋度平板上的菌落數(shù)高，則說明檢驗過程中可能出現(xiàn)差錯或樣品中含抑菌物質(zhì)，這樣的結(jié)果不可用于結(jié)果報告。

2、如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，菌落間沒有明顯的界限，這可能是瓊脂與檢樣混勻時，一個細(xì)菌塊被分散所造成的。一條鏈作為一個菌落計。若培養(yǎng)過程中遭遇昆蟲侵入，在昆蟲爬行過的地方也會出現(xiàn)鏈狀菌落，也不應(yīng)分開計數(shù)。

3、如果平板上菌落太多，不能計數(shù)時，不能用多不可計作報告。應(yīng)在最高稀釋度平板上任意選取2個1cm²的面積，計算菌落數(shù)，除2求出每cm²面積內(nèi)平均菌落數(shù)，乘以63.6(皿底面積cm²數(shù))（這樣說明選擇的稀釋度不合適，生產(chǎn)企業(yè)自檢自控可以這樣報告，正式的報告不能這樣報告）。

4、如果檢樣是微生物類制劑（酸牛奶、酵母制酸性飲料等），在進(jìn)行菌落計數(shù)時應(yīng)將有關(guān)微生物（乳酸菌、酵母菌）排除，不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報告。 

5、每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平板的時間不得超過15min，目的是為了使菌落能在平板上均勻分布，否則，時間放長了，樣液可能由于干燥而貼在平板上，傾注瓊脂后不易搖開，容易產(chǎn)生片狀菌落，影響菌落計數(shù)。另外，瓊脂凝固后不要在室溫長時間放置，應(yīng)及時將平皿倒置培養(yǎng)，可避免菌落的蔓延生長。

6、檢驗過程中應(yīng)用稀釋液做空白對照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時，檢驗過程中應(yīng)在工作臺上打開一塊空白的平板計數(shù)瓊脂，其暴露時間應(yīng)與檢驗時間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗過程中有無受到來自空氣的污染。

7、檢樣稀釋液有時帶有食品顆粒，為避免與細(xì)菌發(fā)生混淆，可以作一檢樣稀釋液與平板計數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4℃冰箱放置，以便在計數(shù)時用作對照。另外也可以在已熔化而保溫在45℃水浴內(nèi)的平板計數(shù)瓊脂中，按100ml加1mL0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液，培養(yǎng)后食品顆粒不變色，細(xì)菌為紅色。