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微生物作業(yè)指導(dǎo)書

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-04-09
核心提示: (一)樣品的采集1.采樣目的確保采集的樣品能代表全部被檢驗的物質(zhì),使檢驗分析更具代表性。2.采樣原則采集的樣品要有代表
 (一)樣品的采集

1.采樣目的

確保采集的樣品能代表全部被檢驗的物質(zhì),使檢驗分析更具代表性。

2.采樣原則

采集的樣品要有代表性,采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進行詳細調(diào)查,檢查是否有污染源存在,同時能反映全部被檢食品的組成、質(zhì)量和衛(wèi)生狀況。

應(yīng)設(shè)法保持樣品原有微生物狀況,在進行檢驗前不得污染,不發(fā)生變化。

采樣必須遵循無菌操作程,容器必須滅菌,避免環(huán)境中微生物污染,容器不得使用煤酚皂溶液,新潔爾滅、酒精等消毒物滅菌,更不能含有此類消毒藥物,以避免殺掉樣品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可使用。

3.采樣數(shù)量

取樣數(shù)量的確定,應(yīng)考慮分析項目的要求、分析方法的要求及被檢物的均勻程度三個因素。樣品應(yīng)一式兩份,分別供檢驗、復(fù)檢使用,每份樣品數(shù)量一般不少于200g。

根據(jù)不同種類采樣數(shù)量略有不同,實驗室檢驗樣品一般為25克。

4.采樣方法

采取隨機抽樣的方式。

直接食用的小包裝食品,盡可能取原包裝,直到檢驗前不要開封,以防污染。

如為非冷藏易腐食品,應(yīng)迅速將所采樣品冷卻至0-4℃。

不要使樣品過度潮濕,以防食品中固有的細菌增殖。

在將冷凍食品送到實驗室前,要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化,不可使其再凍,保持冷卻即可。

5.樣品的保存和運送

樣品采集完后,應(yīng)迅速送往實驗室檢驗,送檢過程中一般不超過3h,如路程較遠,可保存在1-5℃環(huán)境中,如需冷凍者,則在冷凍狀態(tài)下送檢。

冷凍樣品應(yīng)存放在-15℃以下冰箱內(nèi);冷卻和易腐食品應(yīng)存放在0-5℃冰箱或冷卻庫內(nèi);其它食品可放在常溫冷暗處。

運送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。

待檢樣品存放時間一般不應(yīng)超過36小時。

 

(二)檢驗樣品的制備

樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。

檢驗冷凍樣品前應(yīng)先使其融化?稍0-4℃融化,時間不超過18小時,也可在溫度不超過45℃的環(huán)境中融化,時間不超過15分鐘。

檢驗液體或半固體樣品前應(yīng)先將其充分搖勻。如容器已裝滿,可迅速翻轉(zhuǎn)25次;如未裝滿,可于7s內(nèi)以30cm的幅度搖動25次。從混樣到檢驗間隔時間不應(yīng)超過3分鐘。

開啟樣品包裝前,先將表面擦干凈,然后用75%乙醇消毒開啟部位及其周圍。

非粘性液體樣品可用吸管吸取一定量,然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi),吸管插入樣品內(nèi)的深度不應(yīng)超過2.5cm,也不得將吸有樣品的吸管浸入稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)。

粘性液體樣品可用滅菌容器稱取一定量,然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基。

固體或半固體樣品可用滅菌的均質(zhì)杯稱取一定量,再加適量的稀釋液或培養(yǎng)基進行均質(zhì),從樣品的均質(zhì)到稀釋和接種,相隔時間不應(yīng)超過15分鐘,或是在無菌生理鹽水里放入玻璃珠,充分振蕩搖勻。

(三)檢驗

實驗室收到樣品后或是自己取樣后,首先進行外觀檢驗,及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗,檢驗過程中要認真、負責,嚴格進行無菌操作,避免環(huán)境中微生物污染。

檢驗所使用的稀釋液、試劑、培養(yǎng)基接觸的一切器皿必須經(jīng)過有效的滅菌。

實驗室所用儀器、設(shè)備的性能應(yīng)定期檢查和校正。

制備試劑和培養(yǎng)基所用的水,應(yīng)為無離子水或用玻璃器皿蒸餾的蒸餾水。

檢驗結(jié)束后,所有帶菌的培養(yǎng)基、試劑、稀釋液和器皿必須盡快滅菌和洗刷。清洗過的器皿不應(yīng)殘留洗滌劑的痕跡。

 

(四)檢驗記錄和結(jié)果的報告

經(jīng)檢驗的每份樣品都應(yīng)有完整的檢驗記錄。樣品檢驗過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗記錄,以作為對結(jié)果分析、判定的依據(jù),記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。

檢驗結(jié)束后,根據(jù)檢驗結(jié)果,及時填寫檢驗報告書,簽字并經(jīng)負責人審核簽字后發(fā)出。

 

(五)樣品的微生物檢驗流程


 

(六)微生物操作注意要點

無菌操作要求

1)微生物實驗室工作人員,必須有嚴格的無菌觀念,許多實驗要求在無菌的條件下進行,主要原因,一是防止試驗操作中人為污染樣品,二是保證工作人員安全,防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染;

2)接種細菌時必須穿工作服、帶工作帽;

3)進行接種食品樣品時,必須穿專用的工作服、帽及拖鞋,應(yīng)放在無菌室緩沖間,工作前經(jīng)紫外線消毒后使用;

4)接種食品樣品時,應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手,然后用酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?/span>

5)進行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌,打開包裝未使用完的器皿,不能放置后再使用,金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用酒精點燃燒灼三次后使用;

6)從包裝中取出吸管時,吸管尖部不能觸及試管或平皿邊;

7)接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作,接種細菌活樣品時,吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒;

8)接種環(huán)和針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲,必要時還要燒到針和環(huán)與桿的連接處;

9)吸管吸取菌液或樣品時,應(yīng)用相應(yīng)的吸爾球吸取,不得直接用口吸。 

無菌間使用要求

1)無菌間應(yīng)密封,不得隨意打開,并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及門,另盡量設(shè)有小窗,以備進入無菌間后傳遞物品;

2)無菌間應(yīng)保持清潔,工作后用巴氏消毒溶液消毒,擦拭工作臺面,不得存放與試驗無關(guān)的物品;

3)無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊,打開紫外燈消毒(30W,1m)時,照射時間不少于30分鐘,使用紫外燈,應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作,以免引起損傷,燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭,除去上面的灰塵和油垢,以減少紫外線穿透的影響;

4)處理和接種食品樣品時,進入無菌間操作,不得隨意出入,如需要傳遞物品,可通過小窗傳遞。

消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等,必須經(jīng)滅菌后方能使用。

1)滅菌前準備

①所有需經(jīng)滅菌的物品首先要清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密,如用金屬筒應(yīng)將上面氣孔打開。

裝培養(yǎng)基的三角瓶塞好棉塞,試管蓋好蓋,用紙包好。

2)裝放

將物品分別包扎好,直接放入消毒筒內(nèi),物品之間不能過擠。

3)設(shè)備檢查

①檢查門的開關(guān)是否靈活,橡皮圈有無損壞,是否平整。

②壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位,蓋好蓋,通蒸氣或加熱后,觀察是否漏氣,壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合,管道有無堵塞。

③對有自動電子程序控制裝置的滅菌器,使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序,是否符合于進行滅菌處理的要求。

4)滅菌處理

手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進行:

①高壓鍋內(nèi)加入清水(重復(fù)使用時應(yīng)將水量補足,水變混濁需要更換)。

②將要滅菌的物品放入滅菌鍋內(nèi),蓋好蓋子。

接通電源,加熱,水沸騰后打開放氣閥排氣,直到壓力表指針降到0.05Mpa時,關(guān)掉放氣閥。

指針指到121℃時開始計時,達到要求的滅菌時間關(guān)掉開關(guān),冷卻直到壓力降到0.05Mpa即可通過放氣閥緩慢放氣。

5)滅菌溫度與時間

①不同類型培養(yǎng)基的滅菌溫度與時間的關(guān)系見下表:

 

②滅菌處理:滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應(yīng)仔細檢查,以免再度污染。

物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用。

取出的物品,如外包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。

培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達到者應(yīng)廢棄。

取出的物品掉落在地或誤放不潔之處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。

取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴禁與未滅菌物品混放。

凡屬合格物品,應(yīng)標有滅菌日期及有效期限。

每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。

6)有毒有菌污物處理要求

微生物實驗室所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理,一律不得帶出實驗室。

經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴密的容器或鐵絲筐內(nèi),并集中存放在指定地點,待統(tǒng)一進行高壓滅菌。

經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物,必須經(jīng)121℃,30min高壓滅菌。

染菌后的吸管,使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中,最少浸泡24小時,再經(jīng)121℃,30min高壓滅菌。

涂片染色沖洗片的液體,一般可直接沖入下水道,染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后,煮沸洗滌。

打碎的培養(yǎng)物,立即用5%煤酚皂液或石炭酸噴灑和浸泡被污染部位,浸泡半小時后再擦拭干凈。 

7)玻璃器皿的清洗要求

①目的  

為了保證微生物實驗順利進行,保證實驗結(jié)果的準確性,不影響實驗進度,必須把器皿徹底清洗干凈。

②注意事項

任何洗滌方法,都不應(yīng)對玻璃器皿有所損傷,不能用有腐蝕作用的化學(xué)藥劑,也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品來擦拭玻璃器皿。

一般新的玻璃器皿用2%的鹽酸液浸泡數(shù)小時,后用水沖洗干凈。

用過的器皿應(yīng)立即洗滌,放置太久會增加洗滌困難。

強酸、強堿及其它氧化物和有揮發(fā)性的有毒物品,都不能倒在洗滌槽內(nèi),以免污染環(huán)境水質(zhì),必須倒在廢水缸中。

含有對人體有傳染性病菌的器具,應(yīng)先煮沸滅菌后再進行洗滌。

難洗滌的器皿不要與易洗滌的器皿放在一起,以免增加洗滌的麻煩。有油的器皿不要與無油的器皿混在一起,否則使本來無油的器皿沾上了油垢,浪費藥劑和時間。

洗滌劑的種類:水、洗衣粉、檸檬洗滌劑、肥皂。

③洗滌方法

含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿的洗滌方法:事先應(yīng)將器皿中的瓊脂刮去,然后用清水洗滌,并用試管刷刷其瓶壁,以除去粘污在壁上的灰塵和油垢。用洗衣粉水洗去油污,然后用自來水(蒸餾水)沖洗。洗好后的器皿應(yīng)倒置晾干或置于干燥箱中干燥至無水滴。

載玻片及蓋玻片的洗滌法:新載玻片及蓋玻片先在20%的鹽酸溶液中浸一小時,然后用自來水沖洗2~3次,最后用蒸餾水換洗2~3次。用過的載玻片及蓋玻片,應(yīng)用紙擦去油垢,再放在5%的洗衣粉水中煮30分鐘后立即用自來水沖洗,然后放在稀的洗液中浸泡2小時,再用蒸餾水沖洗至中性。

移液管、倒管的洗滌方法:新的移液管及倒管先在的5%鹽酸溶液中浸一小時,然后用自來水沖洗幾次,最后用蒸餾水換洗幾次。用過的移液管、倒管先用自來水洗去表面的殘液,再放在洗衣粉水中浸泡一小時以上,再用自來水沖洗至管內(nèi)壁無殘渣,最后用蒸餾水換洗次,晾干后入恒溫干燥箱中烘干。

8)培養(yǎng)基、無菌水的制備

①基本原理

培養(yǎng)基的種類很多,不同微生物所需要的培養(yǎng)基不同。培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)可分為液體、固體、半固體三種類型,我們實驗室常用的是固體培養(yǎng)基

②器材

三角瓶、試管、燒杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、鋁箔紙、藥勺、杜氏小管、硅膠塞(棉塞)、電爐。

培養(yǎng)基的種類

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基等。

方法步驟

培養(yǎng)基的制備:

稱量:根據(jù)培養(yǎng)基的配方,稱取適量藥品于搪瓷杯中。

溶解:用量筒量取所需水量,置電爐上加熱,一邊攪拌,至完全溶解,加熱至沸騰,拔掉電源,待冷卻。

分裝:根據(jù)不同需要,立即趁熱分裝入三角瓶或試管中,分裝三角瓶以不超過三角瓶一半為宜,分裝試管一般為管長的1/5(需根據(jù)試管的大小而定)。液體培養(yǎng)基如乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基約分裝10毫升左右。

塞橡膠(棉)塞:裝好培養(yǎng)基的試管應(yīng)塞上橡膠(棉)塞,松緊合適,緊貼管壁,不留縫隙,約1/2塞入內(nèi),這樣即可過濾空氣,避免雜菌侵入,又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)。

包裝:三角瓶棉塞頭部應(yīng)用錫箔紙包扎,試管集中于試管簍。

無菌水的制備:

10mL移液管量取9.0mL蒸餾水(稀釋水)裝入試管中。

250mL量筒量取225mL蒸餾水(稀釋水)裝入250mL的三角瓶中,可置少許玻璃珠于三角瓶內(nèi),塞上橡膠(棉)塞用牛皮紙包扎好,高壓滅菌備用。 

9)設(shè)備使用原則

①實驗設(shè)備的使用由實驗員嚴格按照操作說明書進行,其他人員不得隨意操作。

②實驗設(shè)備的日常維護保養(yǎng)由實驗員根據(jù)設(shè)備操作說明書進行,出現(xiàn)不可排除的故障時,經(jīng)部門總經(jīng)理批準,商請專業(yè)人員維修。

③實驗設(shè)備應(yīng)定期進行計量檢測,確保儀器的準確性。

④實驗員應(yīng)愛護儀器設(shè)備,使用前應(yīng)檢查,使用后應(yīng)及時清理清潔,并定期維護保養(yǎng),下班前應(yīng)檢查設(shè)備電源是否關(guān)閉。

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編輯:songjiajie2010

 
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