Sean M. McCarthy, Andrew J. Aubin, 和 Michael D. Jones

沃特世公司(美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德)

■ 快速分離短桿菌肽

■ 載量線性響應(yīng)

■ 準(zhǔn)確、高精度分析短桿菌肽的方法

■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白質(zhì)
 

ACQUITY UPC2系統(tǒng)
ACQUITY® SQD
ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色譜柱

Empower™ 3軟件
 

超高效合相色譜、UPC2、疏水性肽、短桿菌肽

用反相液相色譜(RPLC)分析疏水性肽和蛋白質(zhì)難度很大，因?yàn)槿芤褐薪?jīng)常需要使用洗滌劑保持疏水性物質(zhì)的穩(wěn)定性，而這些洗滌劑容易發(fā)生聚集和/或沉淀，嚴(yán)重影響它們的回收，這些因素以及其它原因使得難以用RPLC分離疏水性肽和蛋白質(zhì)。
 

在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們?yōu)槟�介紹一種在ACQUITY UPC2TM系統(tǒng)上使用沃特世(Waters®)超高效合相色譜技術(shù)分離典型跨膜肽-短桿菌肽的方法。
 

短桿菌肽是由芽孢桿菌產(chǎn)生的一種常見(jiàn)和已被良好表征的跨膜肽物質(zhì)，它被用作對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性和某些革蘭氏陰性細(xì)菌的局部用抗生素，短桿菌肽包括通用組成為甲酰-L-纈氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-纈氨酸-L-纈氨酸-D-纈氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取決于短桿菌肽分子，即分別占總短桿菌肽量約87.5%、7.1%和5.1%的革蘭氏A(X=色氨酸)、革蘭氏B(X=苯丙氨酸)和革蘭氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸單元構(gòu)成_-螺旋狀。
 

我們研究了色譜柱化學(xué)品、流動(dòng)相改性劑和梯度斜率對(duì)分離短桿菌肽的影響。采用優(yōu)化方法分離市場(chǎng)上銷售的非處方藥物(OTC)，將測(cè)定的短桿菌肽濃度與標(biāo)示量進(jìn)行對(duì)比。采用質(zhì)譜儀測(cè)定短桿菌肽的濃度，采用選擇離子譜表征每種物質(zhì)。在ACQUITY  UPC2系統(tǒng)上使用我們的方法，可得到線性和可重復(fù)的結(jié)果——測(cè)定的OTC制劑濃度為標(biāo)示量的98.4%。

測(cè)試條件
 

除非另有說(shuō)明，以下是用于所有色譜最終方法的最佳條件。

UPC2測(cè)試條件

UPC2系統(tǒng): ACQUITY UPC2

檢測(cè)器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率為6 nm(補(bǔ)償400至500 nm)

色譜柱： ACQUITY UPC2CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 μm

柱溫： 50 °C

樣品溫度： 15 °C

UPC2 ABPR: 1885 psi

進(jìn)樣量： 1 μL

流速： 2.0 mL/min

流動(dòng)相A： CO2

流動(dòng)相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有標(biāo)示)

梯度： 20%至30% B，1.5min
 

離子源： ES+

錐孔電壓： 20 V

毛細(xì)管電壓： 3.7kV

源溫度： 150 °C

脫溶劑氣溫度： 500 °C

脫溶劑氣體流速： 400 L/hr

錐孔氣體流速： 25 L/hr

SIR: 922.6,930.3,941.9
 

用解硫胺素芽孢桿菌(短芽孢桿菌)制備的短桿菌肽從Sigma Aldrich公司購(gòu)買，將樣品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL濃度的溶液，如需要，可用甲醇稀釋。含有短桿菌肽的非處方軟膏是從當(dāng)?shù)厮幍曩?gòu)買的。將0.2g軟膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短桿菌肽，去除甲醇層，用0.2-μm的燒結(jié)玻璃盤過(guò)濾，然后直接進(jìn)樣ACQUITY UPC2。
 

我們系統(tǒng)性地篩選了四種色譜柱，測(cè)定哪種分離效果最佳，結(jié)果如圖1所示，色譜柱篩選過(guò)程可在1小時(shí)內(nèi)非�？焖俚赝瓿�。在我們?cè)O(shè)定的篩選條件下，BEH 2-EP和BEH色譜柱未檢測(cè)到譜峰，由于其它色譜柱表現(xiàn)出合適的色譜性能，因而未對(duì)這兩者的非洗脫原因深入研究，其中ACQUITY UPC2CSH氟苯基色譜柱檢測(cè)的色譜峰形最佳，因此采用該色譜柱繼續(xù)研究。

圖1.通過(guò)短桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)物的色譜峰形和保留時(shí)間篩選各種化學(xué)特性色譜柱。所有色譜柱規(guī)格為3.0x100mm，填裝亞-2-微米填料；所有分離條件都采用流動(dòng)相 A：CO2 、流動(dòng)相 B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。
 

為了分離短桿菌肽物質(zhì)，對(duì)酸性改性劑的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短桿菌肽A和短桿菌肽C之間的分離度，結(jié)果如圖2所示。已知TFA會(huì)抑制質(zhì)譜電離，但每種物質(zhì)的信號(hào)都足以定量檢測(cè)治療制劑，后續(xù)將對(duì)此進(jìn)行討論。對(duì)于要求更高靈敏度的應(yīng)用，可能需要降低TFA濃度或使用甲酸，以達(dá)到希望的檢測(cè)限值。

圖2.酸性改性劑對(duì)分離短桿菌肽的影響。
 

當(dāng)設(shè)置好合適色譜條件后，通過(guò)減少梯度時(shí)間優(yōu)化分離過(guò)程，結(jié)果如圖3所示，我們能夠在1.5分鐘時(shí)間內(nèi)使每種短桿菌肽組分的分離度達(dá)到1.4或更高，在相同流速下通過(guò)減少運(yùn)行時(shí)間增加梯度斜率，不但實(shí)現(xiàn)有效分離，同時(shí)還將短桿菌肽A的信噪比從336提高至605。

我們測(cè)試了最佳分離條件，能夠使用單四極桿質(zhì)譜(SQD)檢測(cè)每種物質(zhì)，圖4顯示：每種物質(zhì)都被質(zhì)譜良好分離和檢測(cè)到，另外每種短桿菌肽物質(zhì)都顯示含有絕大多數(shù)的M+2H離子，后續(xù)的研究將使用這些參數(shù)進(jìn)行選擇離子監(jiān)測(cè)。

為了評(píng)估我們的方法是否適用于定量分析市場(chǎng)上銷售的非處方藥中的短桿菌肽，我們?cè)贏CQUITY SQD上使用選擇離子監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖5A所示。我們繪制濃度-峰面積曲線，得到每種物質(zhì)的校正曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：如圖5B-D所示，每種成分在測(cè)試范圍內(nèi)都呈線性響應(yīng)。另外還使用校正曲線測(cè)定了非處方藥物中的每種短桿菌肽物質(zhì)濃度。

使用開(kāi)發(fā)的方法評(píng)估非處方藥物中的短桿菌肽物質(zhì)的濃度和相對(duì)豐度。如圖6所示，重復(fù)分析結(jié)果表明：每種短桿菌肽%RSD值小，計(jì)算濃度與標(biāo)簽上的標(biāo)稱值相吻合；我們還發(fā)現(xiàn)短桿菌肽物質(zhì)的相對(duì)豐度與文獻(xiàn)報(bào)道的豐度非常吻合1。

正如本應(yīng)用紀(jì)要所展示的，ACQUITYUPC2系統(tǒng)與ACQUITYUPC2色譜柱化學(xué)結(jié)合使用，可為短桿菌肽提供簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和可重現(xiàn)的分析方法。該工作表明ACQUITY UPC2系統(tǒng)可用于分析疏水性肽，還可能用于分析疏水性蛋白質(zhì)，例如膜蛋白。
 

The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories; 2001.