由于嬰兒配方奶粉生產(chǎn)商需要檢測每批原料和成品是否存在三聚氰胺和三聚氰酸，因此有必要提供一種快速分析方法。本文所述的基于ACQUITY UPLC/MS/MS的方法由一家大型嬰兒配方奶粉生產(chǎn)商的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)；經(jīng)證實(shí)，該方法非常靈敏且極其耐用，每天能分析100多個(gè)樣本。

近期牛奶和乳制品中含三聚氰胺事件已經(jīng)導(dǎo)致中國數(shù)以千計(jì)的兒童患病，有部分患兒死亡。三聚氰胺（1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺；CAS# 108-78-1）常用于塑料、粘合劑、涂料和阻燃劑的生產(chǎn)。三聚氰酸（1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮；CAS# 108-80-5）是三聚氰胺的一種結(jié)構(gòu)類似物，多作為三聚氰胺的雜質(zhì)而被發(fā)現(xiàn)。這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

三聚氰胺因其高含氮量而在中國某些地區(qū)被用以提高牛奶的表觀蛋白含量。人們認(rèn)為，這兩種化合物相結(jié)合可引起腎毒性。迄今為止，很多監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)提議將其在嬰兒配方奶粉和成人食品中的限量分別定為1.0 ppm（μg/g）和2.5 ppm（μg/g）。美國FDA最近提議1.0 ppm可作為嬰兒配方奶粉成品中三聚氰胺或三聚氰酸的容許量，但規(guī)定這兩種化合物不能同時(shí)存在。其他監(jiān)管機(jī)構(gòu)（如臺灣）將三聚氰胺的限量降低至0.05 ppm。用于檢測面粉1和寵物食品2中的三聚氰胺和三聚氰酸的方法已經(jīng)進(jìn)行過介紹，Shia和Diehl描述了使用特殊的SPE對嬰兒配方奶粉3中三聚氰胺和三聚氰酸進(jìn)行萃取。然而，為確保嬰兒配方奶粉的安全性并盡可能及時(shí)滿足監(jiān)管機(jī)構(gòu)的檢測要求，我們開發(fā)了一種用于同步測定三聚氰胺（MEL）和三聚氰酸（CYA）的高靈敏、更快速的新型檢測方法，以實(shí)現(xiàn)高通量的產(chǎn)品篩查。該方法也適用于分析原料（如酪蛋白或乳清蛋白分離物），從而在用于嬰兒配方奶粉生產(chǎn)前先對其進(jìn)行核實(shí)。同位素內(nèi)標(biāo)用于校正樣品制備過程中出現(xiàn)的微小偏差，并校正儀器對目標(biāo)化合物響應(yīng)中存在的基質(zhì)效應(yīng)。

三聚氰胺和三聚氰酸的儲備液分別溶解于100mL水中而配制出濃度為100μg/mL的溶液�；旌蠘�(biāo)準(zhǔn)溶液通過用流動(dòng)相B將三聚氰胺和三聚氰酸儲備液分別稀釋為 2.5μg/mL和5.0μg/mL而制得�；旌蠘�(biāo)準(zhǔn)溶液每天現(xiàn)用現(xiàn)配。

三聚氰胺（13C3-15N3-三聚氰胺）和三聚氰酸（13C3-15N3-三聚氰酸）的同位素內(nèi)標(biāo)以0.1mg/mL水溶液的形式從劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室購得。分析當(dāng)天，穩(wěn)定的同位素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過將同位素內(nèi)標(biāo)溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液及2%的甲酸乙腈溶液按1:1:2的比例進(jìn)行混合而制得。

■ 對于原料，稱量1.0g樣品放入一個(gè)20mL的玻璃瓶中

■ 添加10.0g水并混勻，使樣品溶解-將溶解后的樣品用作營養(yǎng)品樣品

■ 稱取1.0g產(chǎn)品（粉末或液體）或制備好的原料放入一個(gè)20mL的玻璃瓶中。

■ 加入等量的混合內(nèi)標(biāo)溶液

■ 加入5mL的甲酸水溶液（體積比2%）

■ 通過渦旋混合15秒左右或混合至所有固體均已溶解為止

■ 在第二個(gè)20mL的玻璃瓶中放入9mL含10mM醋酸銨的體積比為97/3的乙腈/水溶液

■ 將1 mL制備好的樣品溶液轉(zhuǎn)移至上述第二個(gè)玻璃瓶。

■ 混勻

■ 通過一個(gè)0.2μm的PTFE濾膜過濾樣品并將濾液收集到進(jìn)樣瓶中

液相色譜系統(tǒng)： 沃特世ACQUITY UPLC®

色譜柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC 2.1 x 150，1.7μm

流動(dòng)相： A：10 mM醋酸銨水溶液   B：溶于97/3乙腈／水的10 mM醋酸銨

弱洗針液： 甲醇

強(qiáng)洗針液： 水

進(jìn)樣針類型： PEEK

定量環(huán)： 10μL

進(jìn)樣類型： 滿環(huán)進(jìn)樣 

 

質(zhì)譜系統(tǒng)： 沃特世ACQUITY? TQD

軟件： 沃特世MassLynxTM 4.1

離子化模式： ESI+

毛細(xì)管電壓： 3.50 kV

離子化模式： ESI-

毛細(xì)管電壓： 3.00 kV

源溫度： 150℃

脫溶劑氣溫度： 400℃

錐孔氣流速： 50 L/小時(shí)

脫溶劑氣流速： 900 L/小時(shí)

碰撞氣流速： 0.15 mL／分鐘

包括同位素內(nèi)標(biāo)在內(nèi)，每個(gè)化合物有2個(gè)離子通道。第二個(gè)通道用于確認(rèn)，峰面積的比例必須與實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)品的相匹配才能被認(rèn)定結(jié)果呈陽性。

 

三聚氰胺和三聚氰酸的校準(zhǔn)曲線通過目標(biāo)化合物和同位素內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)比相對于目標(biāo)化合物濃度而生成。三聚氰胺（0.25 - 40.0ng/mL）和三聚氰酸（0.50 -80.0ng/mL）的校準(zhǔn)曲線均呈線性，儀器得到的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。三聚氰胺和三聚氰酸的校準(zhǔn)殘差均低于10%。典型的校準(zhǔn)曲線和殘差圖如圖2所示

 

該方法的精準(zhǔn)性是通過在方法定量限濃度上對代表性樣品和配料加標(biāo)進(jìn)行評估。成品加標(biāo)量為0.083μg/g三聚氰胺和0.568μg/g三聚氰酸。原料加標(biāo)量為0.416μg/g三聚氰胺和1.26μg/g三聚氰酸。三聚氰胺和三聚氰酸的回收率均介于90 - 110%之間，四天內(nèi)由多位分析員用兩臺儀器得出的八次獨(dú)立測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值幾乎都< 10%。結(jié)果匯總于表1。 

 

方法檢出限（MDL）和方法定量限（MQL）根據(jù)40CFR第136部分附錄B所述的方法進(jìn)行確定。檢出限根據(jù)所測定濃度的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得出，定量限被定義為檢出限的三倍。在8天內(nèi)用兩臺儀器分別對加標(biāo)樣品進(jìn)行分析后，三聚氰胺和三聚氰酸的方法定量限分別被確定為0.039μg/g和0.105μg/g。由于原料分析需要進(jìn)行稀釋，因此檢出限大約高出10倍。

串聯(lián)質(zhì)譜可在選擇反應(yīng)監(jiān)測（或多反應(yīng)監(jiān)測）模式下進(jìn)行選擇性檢測。在這種運(yùn)行模式下，僅可檢出特定母離子/子離子對的化合物。如圖3所示，三聚氰胺的產(chǎn)物離子光譜包含兩個(gè)子離子。

在三聚氰胺分析中同時(shí)監(jiān)測兩個(gè)MS/MS通道而使得方法專一性增強(qiáng)。如果在127→85和127→68 MRM色譜圖中存在相同色譜峰，并且該峰的響應(yīng)比必須在所得到的標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)比的20%以內(nèi)，那么可以鑒定出三聚氰胺陽性的結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)品（0.25ng/mL三聚氰胺和2.0ng/mL三聚氰酸）、一種非強(qiáng)化型嬰兒配方奶粉和一種強(qiáng)化型嬰兒配方奶粉（0.083μg/g三聚氰胺和0.568μg/g三聚氰酸）的典型色譜圖如圖4所示。 

使用同位素內(nèi)標(biāo)可大大增強(qiáng)該方法的定量能力和耐用性。通過這種簡單稀釋和進(jìn)樣程序，每天僅使用ACQUITY TQD即可對100多份樣品是否存在三聚氰胺和三聚氰酸進(jìn)行檢測。經(jīng)證實(shí)，該方法適合分析95%以上的嬰兒配方奶粉、營養(yǎng)品和蛋白粉樣品。在其他情況下，或者對有共流出干擾的復(fù)雜基質(zhì)，應(yīng)采用一個(gè)包括陽離子或陰離子交換SPE的固相萃取（SPE）步驟。 

現(xiàn)已開發(fā)出一種用于同時(shí)測定液體和粉末狀嬰兒配方奶以及成人營養(yǎng)品中三聚氰胺和三聚氰酸的快速而耐用的方法，并根據(jù)40 CFR第136部分進(jìn)行了驗(yàn)證。成品中三聚氰胺的檢出限和定量限分別為0.013μg/g和0.039μg/g，三聚氰酸相應(yīng)為0.035μg/g和0.105μg/g。對于加標(biāo)樣品（n=48、8天、兩臺儀器）而言，三聚氰胺（0.083μg/g）的平均回收率和精確度為100.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)差6.8%；三聚氰酸（0.568μg/g）為99.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)差10.4%。

簡單稀釋后，配備TQ檢測器的ACQUITY UPLC系統(tǒng)可同時(shí)對三聚氰胺和三聚氰酸進(jìn)行快速分析（不到6分鐘）。UPLC?與串聯(lián)質(zhì)譜檢測相結(jié)合提供了卓越的靈敏度和每天分析超過100份樣品的高通量。同位素內(nèi)標(biāo)的加入在較寬的濃度范圍內(nèi)和各種產(chǎn)品類型中提供了良好的線性和定量效果，從而使三聚氰胺和三聚氰酸的鑒定和定量結(jié)果可信。

所述方法具有快速篩查包括嬰兒配方奶粉的蛋白原料、奶源和營養(yǎng)品的能力，從而可確保生產(chǎn)商和監(jiān)管機(jī)構(gòu)能保證產(chǎn)品的安全性和完整性。