在生物藥肽圖分析、蛋白質(zhì)修飾分析、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等諸多工作中,蛋白質(zhì)的變性與酶解是樣品處理的必經(jīng)之路。RapiGestTM SF正是在這個實(shí)驗(yàn)步驟中,用以輔助蛋白酶解的變性試劑[1,2,3]。RapiGest SF有以下優(yōu)點(diǎn):
■ 綜合水相、有機(jī)相溶液條件下,最高效的輔助酶解變性劑。
■ 作用過程中,不對蛋白造成副反應(yīng)化學(xué)修飾。
■ 操作簡單、全面適應(yīng)液質(zhì)分析方法。
■ 常規(guī)操作濃度對胰蛋白酶活性無抑制。
■ 可大大縮短酶解反應(yīng)時間。
■ 對各種蛋白酶、肽-N糖苷酶等多種酶解過程都適用。
在蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的大部分工作中,常常需要將蛋白質(zhì)酶解為多肽進(jìn)行分析。但蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是以三維結(jié)構(gòu)的形式存在的,為了將蛋白高級結(jié)構(gòu)內(nèi)部的酶切位點(diǎn)暴露于蛋白酶的作用下,首先需要對蛋白進(jìn)行變性,使蛋白舒展開。John R. Yates教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)對各種變性劑中的輔助酶切效果進(jìn)行了充分比較,其中RapiGest SF的表現(xiàn)最為(圖1)[4]。仔細(xì)觀察圖1還可以發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,較為常用的尿素輔助酶切效率較差。這是由于尿素對胰蛋白酶活性的抑制作用較大。實(shí)驗(yàn)人員有時會采取使用尿素進(jìn)行蛋白后,將反映溶液稀釋10倍,再加入胰蛋白酶的方法,以降低尿素濃度到1M以下,減少其對胰蛋白酶的抑制。但是,面對微量的生物蛋白樣本,稀釋后的體系,會大幅度降低樣品濃度,限制了后續(xù)的分析工作。此外,尿素在對蛋白變性的過程中,還會對蛋白進(jìn)行一定的化學(xué)修飾,如氨基甲;。副反應(yīng)的發(fā)生對于多肽鑒定、組學(xué)水平蛋白定量會造成一定的影響與誤差。而使用RapiGest SF無副反應(yīng)的問題,正常使用濃度下(0.1%)對胰蛋白酶活
性也無影響(表1)。
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-00-48-33-510998.png)
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-00-48-33-510998.png)
圖1. Tris水相緩沖體系下各種變性劑的輔助酶切效果比較。樣品為mammalian cell lysate cytoplasmic fraction蛋白。
不同變性劑對胰蛋白酶活性影響對比
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-01-59-66-510998.png)
不同變性劑對胰蛋白酶活性影響對比
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-01-59-66-510998.png)
檢測基于胰蛋白酶誘導(dǎo)N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯(BAEE)水解。將0.5微克胰蛋白酶加入1mL 50mM的碳酸氫銨溶液中(pH 7.9,0.2 mM BAEE)。檢測△BAEE在253 nm下的吸收值(5分鐘內(nèi)的斜率)。
RapiGest SF雖然是一種表面活性劑,但其全面適應(yīng)液質(zhì)分析的要求。在使用RapiGest SF作為變性劑完成蛋白酶切后,如果只進(jìn)行色譜分析,則可無需對RapiGest SF進(jìn)行處理。如進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析,則通過簡單的加酸步驟就可將RapiGest SF去除。而酸性溶液環(huán)境又恰恰是液質(zhì)分析所需的樣品溶液環(huán)境。事實(shí)上,RapiGest SF是酸性不穩(wěn)定表面活性劑,在酸性條件下(pH2)極易水解。RapiGestSF的結(jié)構(gòu)及其水解產(chǎn)物見圖2。酸化后RapiGest SF降解為兩個產(chǎn)物:2-十二酮和3-羥(2,3-二羥基丙基)丙磺酸鈉。前者與水不能互溶,通過離心去除。后者在水溶液中溶解度很高,在反相LC模式下不保留。因此,酶消解后的水溶液可直接進(jìn)行LC-MS或MALDI-MS分析。
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-02-33-29-510998.png)
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-02-33-29-510998.png)
圖3為Ra piGest SF輔助的人單抗酶解的實(shí)例。通過BiopharmaLynxTM軟件分析,其序列覆蓋度為98%。而且LC/MS
分析中沒有發(fā)現(xiàn)錯誤酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。2%序列未發(fā)現(xiàn)的原因是由于此部分序列為2個氨基酸的超短肽或單個氨基酸(R或K),其無法在反相柱上保留。
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-02-57-33-510998.png)
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-02-57-33-510998.png)
圖 3.LC-MS分析RapiGest SF輔助下的人單抗胰蛋白酶酶解多肽。
由于其表面活性劑的屬性,RapiGest SF可以非?焖俚貙Φ鞍淄瓿勺冃,從而縮短酶解實(shí)驗(yàn)時間。圖4顯示,RapiGest SF輔助下,完全酶解馬肌紅蛋白只需要5分鐘。而由于肌紅蛋白屬球蛋白,其在不充分變性的情況下將難以酶解。在對照反應(yīng)中,單純與胰蛋白酶孵育條件下,即使到9小時后,仍只有少量的蛋白被酶解;而使用了RapiGest SF試劑的體系,酶解效率顯著提升。
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-03-25-40-510998.png)
![](http://file1.foodmate.net/file/upload/201207/25/09-03-25-40-510998.png)
圖 4.有無RapiGest SF輔助下,馬肌紅酶解效果對比。
RapiGest SF自2002年推出以來,已經(jīng)過10年的使用,它良好的性能被廣泛認(rèn)可,對各種蛋白酶、肽-N糖苷酶
等多種酶解過程都適用[5]。RapiGest SF已經(jīng)成為大部分生物質(zhì)譜科學(xué)家的常規(guī)必備試劑。
參考文獻(xiàn)
(1) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly,mass spectrometry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem. 2003, 75, 6023-6028.
(2) Huang HZ, Nic hols A, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem. 2009, 81, 1686-1692.
(3) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18, 711-715.
(4) Chen EI, Cociorva D, Norris JL, Yates JR 3rd. Optimization of Mass Spectrometry-Compatible Surfactants for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 2007, 6, 2529-2538.
(5) Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometryc haracterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 2331-2336.