標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作要求

一

按GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》推薦：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的被測量范圍；2、標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分盡量與被測樣品組分一致；3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距離的分布在被測量范圍；4、標(biāo)準(zhǔn)樣品的個數(shù)至少應(yīng)有3個濃度；5、每個標(biāo)準(zhǔn)點至少重復(fù)2次，這個重復(fù)是指從稀釋開始；如果國家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦，盡量按國家標(biāo)準(zhǔn)，如果你要偷懶，比如我要減少標(biāo)準(zhǔn)點，至少要有理論標(biāo)準(zhǔn)支撐，比如至少要3個濃度。工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn)，因為線性方程最為簡潔。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的作法

二

(1)標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測樣品的可能變異最低與最高值，一般可選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級增加，并應(yīng)與被測液同樣條件下顯色測定。

(2)標(biāo)準(zhǔn)液的測定：在比色時，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：一般常用的是光密度--濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

①用普通方格紙作圖。圖紙最好是正方形(長：寬=l：1)或長方形(長：寬=3 ：2)，以橫軸為濃度，縱軸為光密度，一般濃度的全距占用了多少格，光密度的全距也應(yīng)占用相同的格數(shù)。

在適當(dāng)范圍內(nèi)配制各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，求其光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度位置向上延長，光密度位置向右延長、交點即為此座標(biāo)標(biāo)點。然后，將各坐標(biāo)點和原點聯(lián)成一條線，若符合Lambert-Beer氏定律，則系通過原點的直線。

②若各點不在一直線，則可通過原點，盡可能使直線通過更多點，使不在直線上的點盡量均勻地分布在直線的兩邊。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制完畢以后，應(yīng)在座標(biāo)紙上注明實驗項目的名稱，所使用比色計的型號和儀器編號、濾光片號碼或單色光波長以及繪制的日期、室溫。

④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：一般應(yīng)作二次或三次以上的平行測定，重復(fù)性良好曲線方可應(yīng)用。

⑤繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相同條件下操作測定相同物質(zhì)時使用。當(dāng)更換儀器、移動儀器位置、調(diào)換試劑及室溫有明顯改變時，標(biāo)準(zhǔn)曲線需重新繪制。

⑥標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)的標(biāo)度：從標(biāo)準(zhǔn)液的含量換算成待測液的濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的核心問題要解決

三

1、能找到確切濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品。

2、標(biāo)準(zhǔn)系列和待測物質(zhì)一定要有相同和一致的基體，因為樣品基體可能會干擾儀器的響應(yīng)，從這個意義上講，樣品的前處理實際就是提供標(biāo)準(zhǔn)和樣品同樣的基體環(huán)境，盡量祛除干擾基體。所以最好的標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)該是樣品基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)系列。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作注意事項

四

對于分析定量來說，如果標(biāo)線沒有做好，那么即使前處理做的再好，回收率再好，也會使你的結(jié)論失去一定的參考價值！也失去了與其他人員測試數(shù)據(jù)的可比性！要做好定量工作除了儀器正常外，我們也要配制好一條好的標(biāo)線：

1.首先盡量選取有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不管是直接要用的母液還是要配置成母液的其他物質(zhì)（如固體，粉末等）！選取有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是為了大家都有一個共同的基準(zhǔn)（量值溯源）！如果實在是在沒有有證書的母液條件下，就用有證書的其他物質(zhì)來配置！如果有就最好用有證書的物質(zhì)，因為自己配置的母液會帶來一定的誤差！

2.在配置時要把所有要用到的工具（容量瓶、移液槍、移液管等）進(jìn)行校正，最好拿到國家計量中心或有資質(zhì)的部門校正！有校正能力的實驗室也可自己校正！

3.防止污染！要洗凈所要用到的工具！對于離子色譜來說，主要使用去離子水清洗！

4.配制好標(biāo)液后，及時上機(jī)，避免有的物質(zhì)不穩(wěn)定或易被污染！

但在常規(guī)實驗室中也只有常規(guī)分析的時候，相對比較容易些，而現(xiàn)目前不少實驗項目均要求檢測ppb級含量的物質(zhì)，IC是很容易引入污染的（Cl、Na等）。跨越幾個數(shù)量級時，線性系數(shù)雖然很好，但是RSD值卻很大，痕量分析的定量誤差是相當(dāng)?shù)拇蟆?/span>

5.選取合適的方程。根據(jù)物質(zhì)的和檢測器的特性，選取合適的線性方程。（比如是否要強(qiáng)制過原點，是直線還是二次方程等）

6.檢查線性是否合格。除線性本身的一些參數(shù)：RSD值是否小于一定值比如（5%），線性相關(guān)系數(shù)是否達(dá)到比如四個九以上，如果不是強(qiáng)行過原點的一次方程的節(jié)距是否合理等外，還要檢查濃度的準(zhǔn)確性，因為一定濃度的母液，按一定比例稀釋都可成一定線性的，但濃度就不一定就是所需要的！所以光看線性好，是不能代表所做的標(biāo)線就是合格的。

7.標(biāo)線的準(zhǔn)確性除儀器自身的回收率、響應(yīng)值等相關(guān)外，另外我們可以做到：

⑴不同的人員配置標(biāo)線和QC；

⑵防止母液是否有問題，要做標(biāo)液的新舊對比或者不同的牌子的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（參考物質(zhì)）進(jìn)行監(jiān)控和或使用或次級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（參考物質(zhì)）開展內(nèi)部質(zhì)量控制；

⑶參加實驗室間的比對或能力驗證；

⑷使用相同或不同方法進(jìn)行重復(fù)檢測或校準(zhǔn)；

⑸對存留物品進(jìn)行再檢測或再校準(zhǔn)。

8.標(biāo)線合格后，還要通過QC等觀察標(biāo)線的使用壽命！

常見問題：

五

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要人為的增加（0,0）點嗎？

不能。通常的標(biāo)準(zhǔn)系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說法，沒做實驗人為添加（0,0）很不妥，因為很多時候0管進(jìn)入儀器可能也有響應(yīng)值，這也是我們考察試劑空白的一個重要步驟。這個0管在某些時候非常重要，比如全血鉛測定，我們采用牛血清來基體匹配標(biāo)準(zhǔn)系列，如果此時你用酸做空白或沒做實驗人為添加（0,0），那你就很難做好標(biāo)準(zhǔn)曲線。所以標(biāo)準(zhǔn)曲線的0管也是做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的重要考慮點。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要減掉試劑空白來做嗎？

不需要。儀器測出來標(biāo)準(zhǔn)系列的響應(yīng)值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應(yīng)值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調(diào)零。其實沒有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應(yīng)值，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時，我們已經(jīng)認(rèn)為該響應(yīng)值就是0濃度，也就是扣除了這個空白的。

3.什么時候用Y=bX和二次曲線呢？

標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計檢驗，且要做統(tǒng)計完備的線性檢驗和失擬檢驗，然后再做a與0的差別檢驗，如果a與0的統(tǒng)計學(xué)上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗和失擬檢驗，如果線性檢驗合格（P<0.05）且失擬檢驗合格（p>0.05）此時你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗和失擬檢驗合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計簡潔性原則。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線去查含量時是先減空白信號算樣品含量還是先算出空白含量相減呢？

工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號減空白信號然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實這種差距往往是低含量水平時才出現(xiàn)，在低含量水平通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個人推薦先用樣品信號減空白信號然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量，因為這樣出來的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時的不確定度，因為好的測量永遠(yuǎn)是不確定度小的測量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法區(qū)別？

六

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

也稱外標(biāo)法或直接比較法，是一種簡便、快速的定量方法。與分光光度分析中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似，首先用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體方法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與待測組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確進(jìn)樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，此標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)是通過原點的直線。若標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點，則說明存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率即為絕對校正因子。

在測定樣品中的組分含量時，要用與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線完全相同的色譜條件作出色譜圖，測量色譜峰面積或峰高，然后根據(jù)峰面積和峰高在標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查出注入色譜柱中樣品組分的濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點是：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測定工作就變得相當(dāng)簡單，可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點是：每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應(yīng)性能，柱溫，流動相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），而實際樣品的組成卻千差萬別，因此必將給測量帶來一定的誤差。

2.標(biāo)準(zhǔn)加入法，又名標(biāo)準(zhǔn)增量法：

是一種被廣泛使用的檢驗儀器準(zhǔn)確度的測試方法。這種方法尤其適用于檢驗樣品中是否存在干擾物質(zhì)。

具體方法是：將一定量已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入待測樣品中，測定加入前后樣品的濃度。加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后的濃度將比加入前的高，其增加的量應(yīng)等于加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含的待測物質(zhì)的量。如果樣品中存在干擾物質(zhì)，則濃度的增加值將小于或大于理論值。

總的來說，標(biāo)準(zhǔn)曲線法適用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的基體和樣品的基體大致相同的情況，優(yōu)點是速度快，缺點是當(dāng)樣品基體復(fù)雜時不正確。標(biāo)準(zhǔn)加入法可以有效克服上面所說的缺點，因為他是把樣品和標(biāo)準(zhǔn)混在一起同時測定的，但他也有缺點就是速度很慢。標(biāo)準(zhǔn)曲線法可在樣品很多的時候使用，先做出曲線，然后從曲線上找點，那樣方便。標(biāo)準(zhǔn)加入法，適合數(shù)量少的時候用。