淋巴細胞培養(yǎng) (Lymphocyte culture) 正常成熟的淋巴細胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細胞卻能在體外持續(xù)傳代，這是病毒轉(zhuǎn)化細胞的例證，也是分離出EBV的標志。T淋巴細胞在加入T細胞生長因子(IL-2)后可在體外培養(yǎng)，為研究人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV、HTLV)提供了條件，HIV在T淋巴細胞培養(yǎng) 物中增殖形成多核巨細胞。

2.動物試驗 這是最原始的病毒分離培養(yǎng)方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據(jù)各病毒對組織的親嗜性而定，可接種鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、腹腔或靜脈，例如嗜神經(jīng)病毒(腦炎病毒)接種鼠腦內(nèi)，柯薩奇病毒接種乳鼠(一周齡)腹腔或腦內(nèi)。接種后逐日觀察實驗動物發(fā)病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作鑒定。

3.雞胚培養(yǎng) 用受精孵化的活雞胚培養(yǎng)病毒比用動物更加經(jīng)濟簡便。根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi)，如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng)；但很多病毒在雞胚中不生長。

(二)分離病毒的鑒定

1.病毒在細胞內(nèi)增殖的指征

(1)細胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病毒在細胞內(nèi)增殖引起細胞退形性變，表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學倒置顯微鏡下可觀察上述細胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預測性診斷(表80-4)。免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點，細胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。

表80-4 病毒在細胞內(nèi)增殖的指征

(2)紅細胞吸附現(xiàn)象(Hemadsorption phenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后24-48小時，以細胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細胞，發(fā)生紅細胞吸附現(xiàn)象。若加入相應的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱為紅細胞吸附抑制試驗。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。

(3)干擾現(xiàn)象 (Interference phenomenon) 一種病毒感染細胞后可以干擾另一種病毒在該細胞中的增殖，這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒(如風疹病毒)但能干擾以后進入的病毒(如ECHO病毒)增殖，使后者進入宿主細胞不再生產(chǎn)CPE。

2.病毒感染性的定量測定

空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU) 測定 這是一種測定病毒感染性比較準確的方法。將適當濃度的病毒懸液接種到生長單層細胞的玻璃平皿或扁瓶中，當病毒吸附于細胞上后，再在其上復蓋一層溶化的半固體營養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當病毒在細胞內(nèi)復制增殖后，每一個感染性病 毒顆粒在單層細胞中產(chǎn)生一個局限性的感染細胞病灶，病灶逐漸擴大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”，清楚可見。由于每個空斑由單個病毒顆粒復制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來表示。

(2)50%致死量(LD50)或50%組織細胞感染量(TCID50)的測定 本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時間后，觀察細胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計學方法計算出50%感染量或50%組織細胞感染量，可獲得比較準確的病毒感染性滴度。

3.病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察 病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組 織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。

4.血清學鑒定 用已知的診斷血清來鑒定。補體結(jié)合試驗可鑒定病毒科屬；中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應結(jié)合臨床癥狀，檢材來源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復期雙份血清作血清學試驗，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。

三、病毒核酸及抗原的直接檢出

(一)直接檢出病毒核酸

1.核酸雜交(Nucleic acid hybridization) -臨床病毒學中報速診斷方法通常是檢測標本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點雜交 (Dot hybridization) 廣泛用于檢測呼吸道標本，尿標本中的病毒核酸。標本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結(jié)合到膜上，在原位進行鹼變性處理后，有放射標記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按鹼基到補原則結(jié)合成雙股，經(jīng)放射自顯影，陽性結(jié)果出現(xiàn)斑點狀雜交信號。含輪狀病毒的糞便標本經(jīng)熱變性處理，點到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標記探針做斑點雜交，敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補的DNA探針做斑點雜交。

目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病 人標本中的病毒DNA，也用于檢測不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標本中的病毒DNA。

2.多聚酶鏈反應 (Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴增法。先將待檢標本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個鹼基互補的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3�端引物向5�端延伸DNA鏈，經(jīng)20～40個循環(huán)，可使1個拷貝的核酸擴增至106以上，經(jīng)瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標本，有較大應用前景。

(二)直接檢測病毒抗原

1.免疫熒光(IF)技術(shù) 如前所述IF可用于細胞培養(yǎng) 病毒的鑒定，也適用檢測臨床標本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標記特異性抗體，檢測病毒抗原；間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標本中抗原結(jié)合，再用熒光素標記的抗體與特異性抗體結(jié)合，從而間接識別抗原。可取咽喉脫落細胞，檢測呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或腦活檢標本，檢測單純皰疹病毒抗原；取尿沉渣檢測巨細胞病毒抗原等。近年來使用單克隆抗體大大提高了檢測的靈敏度和準確性。

2.免疫酶法(IEA) 原理與應用范圍同免疫熒光技術(shù)，IEA是用酶(通常是過氧化物酶)取代熒光素標記抗體，酶催化底物形成有色產(chǎn)物，在普通光學顯微鏡下清晰可見，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。

3.放射免疫測定法(RIA) 有競爭RIA和因相RNA二種方法。競急RIA是同位素標記的已知抗原與標本中未標記的待檢抗原競爭性結(jié)合特異性抗體的試驗，將形成的復合物分離出來，用放射免疫檢測儀測定放射活性，同時與系列稀釋的標準抗原測定結(jié)果進行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標本中的抗原，然后加入放射性標記的特異性抗體與抗原結(jié)合，測定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 先將特異性抗體包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉標本中相應抗原，然后加入酶標特異性抗體，相應抗原被夾在抗體之間，當加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質(zhì)，已被多數(shù)實驗室采用。

此外，對難以分離培養(yǎng)，形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。

四、特異性抗體的檢測特異性抗體的檢測

病毒感染后通常誘發(fā)針對病毒一種或多種抗原免疫應答，特異性抗體效價升高或lgM抗體出現(xiàn)有輔助臨床診斷的價值。

(一)補體結(jié)合試驗(CF) CF分二個階段：1.抗原與抗體(一個為已知，一個為待檢)混合，加入定量補體，若抗原與抗體相對應，則補體被消耗；2.在上述混合物中加入溶血素致敏的綿羊紅細胞，若補本已與抗原抗體復合物完全結(jié)合，沒有剩補體存在，那么綿羊紅細胞不會溶血，結(jié)果為陽性，說明待檢標本中有特異性存在，出現(xiàn)陽性結(jié)果時血清標本最高稀釋度為抗體的效價。反之為陰性結(jié)果。由于補體結(jié)合抗體產(chǎn)生早，消失快，適于診斷病毒近期感染。(表80-5)。

*此例的抗體效價升高4倍，有診斷意義。

(二)中和試驗(NT) 在活體或活細胞內(nèi)測定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗。試驗時：①須先測出病毒的半數(shù)致死量(LD50)或半數(shù)感染量(ID50)；②隨即取活病毒與被試血清按不同比例混合，放置1～2小時讓其充分中和；③將病毒與血清混合液注入各組動物、雞胚或組織細胞培養(yǎng)管內(nèi)培養(yǎng)；④根據(jù)動物、雞胚死亡數(shù)或細胞病變的管數(shù)，計算出百分比(%)，然后再計算這些試驗對象中的半數(shù)免于死亡或免于致病所需要的最少量血清(或最大量的病毒)，就是該血清的中和抗體效價(稱為50%終點的中和效價)。診斷病毒性疾病時，須取病人雙份血清同時做對比試驗，病后血清的中和抗體效價也必須超過病初血清4倍以上，才能確診(表23-6)。用此法鑒定病毒時，須將病毒分別與免疫血清及血清正常血清(對照)混合做對比試驗，免疫血清比正常血清多中和50～100倍劑量的病毒，才能斷定是該病毒。、

表80-6 病人雙份血清的病毒中和試驗結(jié)果(組織細胞培養(yǎng)的中和試驗)

說明：
①TCID50=組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量。

②每種稀釋度接種4支組織細胞培養(yǎng)管；0=未出現(xiàn)細胞致病作用；+=出現(xiàn)細胞致病作用。

③此例的病后血清中和抗體效價比病初血清增高8倍，有診斷意義。

病毒中和抗體的特異性高，持續(xù)時間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長期存在中和抗體，所以適用于流行病學調(diào)查或人群免疫水平研究，但因試驗方法繁雜，耗用動物、雞胚或細胞培養(yǎng)較多，故一般不作常規(guī)使用。

(三)血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibition test,HIT)某些病毒(流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腦炎病毒等)能凝集紅細胞，而抗體與這些病毒結(jié)合后卻能阻止它們的凝集，若雙份血清有≥4倍以上滴度增高，也可用于診斷這類病毒感染。本法簡便、快速、經(jīng)濟、特異性高，常用于流行病學調(diào)查等。

(四)lgM捕捉ELISA 特異性lgM出現(xiàn)于病毒感染的早期或病毒感染的活動期，因此可從急性期病人單份血清中檢出特異性lgM，這是病毒感染實驗室早期診斷的可靠方法。實驗中先用u鏈血清包被微培板孔，用以捕捉血清標本中的lgM類抗體，再加入特異性病 毒抗原及酶標抗體以證實特異性lgM的存在�，F(xiàn)已廣泛用于病毒病的早期診斷。在先天性感染中，lgM檢測有特殊意義，因lgM不能通過胎盤，新生兒血清中發(fā)現(xiàn)抗病毒lgM提示為宮內(nèi)感染。