1.形態(tài)與染色

　　本菌為革蘭氏染色陰性菌,螺旋形,彎曲桿狀,大小為(0.2-0.8)μmX(0.5-5)μm，有一個(gè)以上螺旋并可長(zhǎng)達(dá)8μm,也可出現(xiàn)S形或似飛翔的海鷗形，菌體一端或二端有單根鞭毛，長(zhǎng)度約為菌體的2-3倍，有活潑的動(dòng)力或不產(chǎn)生動(dòng)力，超過48小時(shí)的培養(yǎng)物以衰老的球菌狀居多。

2.培養(yǎng)特性

　　彎曲桿菌是一類微需氧菌，初次分離時(shí)需在含5%氧、85%氮、10%二氧化碳環(huán)境中，該菌相對(duì)脆弱，對(duì)周圍環(huán)境敏感，如對(duì)干燥、加熱、消毒、酸性和21%氧氣的空氣都敏感。培養(yǎng)適宜溫度為25-43℃，最適宜溫度為42℃。最適pH7.2。對(duì)糖類既不發(fā)酵也不氧化，呼吸代謝無酸性或中性產(chǎn)物。在布氏肉湯中生長(zhǎng)呈均勻混濁。在血瓊脂上，初分離出現(xiàn)兩種菌落特征：第一型菌落不溶血，灰色，扁平，潤(rùn)濕，有光澤，看上去像水滴，邊緣不規(guī)則，常沿劃線生長(zhǎng)；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的單個(gè)菌落（直徑1mm-2mm），邊緣整齊，半透明，有光澤，中心稍渾，呈單個(gè)菌落生長(zhǎng)。

3.生化特性

　　彎曲菌屬各個(gè)種的生化特性見表一。

表一 彎曲菌屬各個(gè)種的生化特性

注：＋：90％以上陽性；D：11－89％陽性；－：90％以上陰性 ；〔－〕：一般不生長(zhǎng)。

R為耐受，S為敏感。

　　空腸彎曲桿菌感染稱為彎曲桿菌病，引起腹瀉。據(jù)報(bào)道，從腹瀉患者分離出此菌的分離率大大高于沙門氏菌。研究表明，該菌少至500個(gè)也可致病，但很少發(fā)生死亡，死亡率為千分之一。最易感人群是5歲以下兒童和15－29歲的青年。該菌廣泛存在于鳥、禽、貓、狗等動(dòng)物體內(nèi)，從牛奶、蟹肉、河水和無癥狀人群糞便中可分離到此菌。健康的雞和奶牛攜帶該菌。彎曲桿菌已涉及生的和未煮熟的雞、生的和巴氏殺菌不徹底的牛奶、蛋制品、生火腿、未經(jīng)氯處理的水。

　　本菌抵抗力不強(qiáng)，易為干燥、直射陽光及弱消毒劑等殺滅，58℃5分鐘可殺死。對(duì)青霉素、頭孢霉素耐受，對(duì)紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素敏感。

　　彎曲桿菌在膽管中生長(zhǎng)，小腸上端微需氧環(huán)境適宜本菌生存和繁殖，造成空腸、回腸和大腸組織損傷，通過腸粘膜侵入血液�？漳c彎曲菌感染的患者，臨床表現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、嘔吐和肌肉痛。潛伏期平均3－5天，病程7－10天。1－2天后，糞便的特征是帶血，鏡檢中有多形核白血球，重癥病例也有痢疾樣血、粘液便，常誤診為急性潰瘍性腸炎。該菌感染自然恢復(fù)，抗生素能進(jìn)一步限制感染病人糞便中細(xì)菌的存活時(shí)間。

1.增菌：

A、碎牛肉

　　稱取25g樣品,置于勻質(zhì)杯中,加入100mL增菌肉湯.用勻質(zhì)器以8000-10000r/min勻質(zhì)30s。將勻質(zhì)液通過滅菌紗布,倒入250mL三角瓶中,于微氧條件下,37℃預(yù)增菌4h后,42℃培養(yǎng)20-44h。

B、凈膛全禽和分割肉

　　在一個(gè)滅菌容器中,用250mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯振搖洗滌樣品5min.肉湯經(jīng)滅菌紗布過濾,于23000xg、4℃離心20min,或于16300xg、4℃離心30min,棄去上清液,將沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉湯,搖勻。 于微氧條件下,37℃預(yù)增菌4h后,42℃培養(yǎng)20-44h。

C、牛奶

　　稱取40g牛奶放入離心管中,按2.條中方法離心.棄去脂肪和上清液將沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉湯,搖勻。于微需氧條件下,35℃預(yù)增菌4h后,42℃培養(yǎng)20-44h。

D、貝類

　　將100g樣品和100mL增菌肉湯放入均質(zhì)杯中,用均質(zhì)器以8000-10000r/min均質(zhì)30s。用滅菌紗布過濾,取濾液50mL濾液放入500mL三角瓶中,加入200mL增菌肉湯, 于微氧條件下,37℃預(yù)增菌4h后,42℃培養(yǎng)20-44h。

E、河水或污水

　　取水樣2-4升,每升水樣加入5mL1M硫代硫酸鈉,用0.45μm微孔濾膜過濾,立即將濾膜置

　　于100mL增菌肉湯中, 于微氧條件下,30℃預(yù)增菌3h后,再于37℃增菌2h,然后于42℃培養(yǎng)20-44h。

2.分離和初步鑒定

　　取5mL經(jīng)20-44h增菌的培養(yǎng)物,以0.65μm孔徑濾膜過濾.取經(jīng)過濾和未經(jīng)過濾的增菌培養(yǎng)物,分別在分離用瓊脂平板上劃線接種,各不少于二個(gè)平板.將平皿置于微需氧條件下42℃培養(yǎng)24-48h。檢查平板上有無透明-白色-棕黃色(可能出現(xiàn)淺紅色)凸起、邊緣不整齊、有時(shí)沿接種線向外擴(kuò)散的菌落.挑取典型菌落制作濕片,用相差(或暗視野)顯微鏡檢查,本菌呈快速螺旋運(yùn)動(dòng)。涂片作革蘭氏染色鏡檢時(shí),本菌為革蘭氏陰性,如小逗點(diǎn)狀,兩菌體的末端相連時(shí),呈S形、海鷗形或螺旋狀.挑取初步鑒定為彎曲桿菌的菌落,在布氏瓊脂上劃線作純分離。培養(yǎng)方法同上。根據(jù)生化、生長(zhǎng)特性和抗生素敏感性試驗(yàn)進(jìn)行菌株證實(shí)。

3.證實(shí)試驗(yàn)

　　從用作純分離的平板挑選二個(gè)典型菌落。從每個(gè)典型菌落各挑取一滿接種環(huán),分別接種于50mL三角瓶中的4mL布氏肉湯中,于微需氧條件下42℃培養(yǎng)24-48h.同時(shí)接種一份陽性培養(yǎng)物作為對(duì)照。通常用于生長(zhǎng)試驗(yàn)和生化反應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)物是含0.18%瓊脂的布氏肉湯。該培養(yǎng)基分裝于試管中,每管7mL。從所有布氏肉湯中取出接種物,滴加0.2-0.3mL于瓊脂表面。

(1).生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)

　　接種3管含0.002%中性紅(NR)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其中一管置于37℃培養(yǎng),檢查在這一溫度下的生長(zhǎng)情況,并用于觀察過氧化氫酶反應(yīng)。另二管分別置于25和42℃培養(yǎng)。每日檢查有無生長(zhǎng)。對(duì)未生長(zhǎng)者,需培養(yǎng)5d方可作出最后判斷。彎曲桿菌的生長(zhǎng)僅限于接近培養(yǎng)基表面的一薄層,廣泛的生長(zhǎng)不是彎曲桿菌屬細(xì)菌所致。

(2).過氧化氫酶試驗(yàn)

　　滴加3%過氧化氫溶液于有細(xì)菌生長(zhǎng)的試管中,產(chǎn)生氣泡者為陽性反應(yīng)。

(3).氧化酶試驗(yàn)

　　使用瓊脂平板表面經(jīng)24h培養(yǎng)的生長(zhǎng)物.將氧化酶試劑滴于棉拭子上,用棉拭子接觸生長(zhǎng)物表面,接觸點(diǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色者為陽性。

(4).硝酸鹽還原試驗(yàn)

　　將供試培養(yǎng)物接種于含1%硝酸鉀的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置空氣中于37℃培養(yǎng)5d.加入亞硝酸鹽檢測(cè)試劑,出現(xiàn)紅色者為陽性反應(yīng)。

(5).1%甘氨酸中生長(zhǎng)試驗(yàn)

　　將供試培養(yǎng)物接種于加有NR和1%甘氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。置空氣中于37℃培養(yǎng).每日檢查有無生長(zhǎng),對(duì)未生長(zhǎng)者需培養(yǎng)5d,方可作出最后判斷。

(6).3.5%氯化鈉中生長(zhǎng)試驗(yàn)

　　將供試培養(yǎng)物接種于加有NR和3.5%氯化鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。置空氣中于37℃培養(yǎng).每日檢查有無生長(zhǎng),對(duì)未生長(zhǎng)者需培養(yǎng)5d,方可作出最后判斷。

(7).硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)

　　將肉湯培養(yǎng)物接種于加有0.02%鹽酸半胱氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將一根浸有飽和乙酸鉛的濾紙條懸于試管的上部(不讓濾紙條接觸培養(yǎng)基),旋緊試管帽。 置空氣中于37℃培養(yǎng).每日檢查，觀察濾紙條是否變黑，變黑表明有硫化氫產(chǎn)生，為陽性反應(yīng)。對(duì)未出現(xiàn)陽性反應(yīng)者需培養(yǎng)5d,方可作出最后判斷。

（8）.TSI試驗(yàn)

　　接種于TSI斜面，于微需氧條件35－37℃培養(yǎng)5d.空腸彎曲菌不產(chǎn)生硫化氫。所有彎曲桿菌屬為堿性/堿性反應(yīng)。

(9).麥康凱試驗(yàn)

　　將供試培養(yǎng)物接種于麥康凱培養(yǎng)基,于微需氧條件37℃培養(yǎng)3d,記錄有無生長(zhǎng)。

(10).馬尿酸鹽水解試驗(yàn)

　　用試管分裝馬尿酸鹽水解培養(yǎng)基,每管0.4mL,凍存?zhèn)溆�。將瓊脂平板上培養(yǎng)過夜的生長(zhǎng)物接種于1%馬尿酸溶液中,振搖后置37℃水浴中放置2h。每管加入0.5mL茚三酮試劑(將3.5g茚三酮溶于100mL1:1丙酮和丁醇中),室溫下放置2h,出現(xiàn)紫色者為陽性反應(yīng)。

(11).抗生素敏感性試驗(yàn)

　　用滅菌棉拭子將預(yù)先準(zhǔn)備好的布氏肉湯培養(yǎng)物涂布于布氏瓊脂平板。將頭孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圓紙片分別貼于平板表面。于微需氧條件37℃培養(yǎng)24h,檢查有無抑菌圈。

　　根據(jù)生化鑒定結(jié)果表對(duì)細(xì)菌作出鑒定。

附: 抗生素溶液

　　頭孢哌酮鈉（Sodium cefoperazone）:稱取0.5g,用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。經(jīng)0.22μm濾膜過濾。該溶液4℃保存5天。

　　三甲氧卞氨嘧啶乳酸鹽:稱取0.66g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。經(jīng)0.22μm濾膜過濾。該溶液4℃保存1年。

　　萬古霉素: 稱取0.5g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。經(jīng)0.22μm濾膜過濾。該溶液4℃保存2個(gè)月。

　　放線菌酮: :稱取1.25g, 用乙醇溶解后,用水定容于100mL容量瓶中。該溶液4℃保存1年。

　　每1000mL經(jīng)滅菌的布氏增菌肉湯中加入以上4種溶液各4 mL。